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微射流高压均质和加热处理对牛乳MFG 在模拟消化各阶段物理化学变化和消化特性的影响，通过静态体外消化模型探究。生牛乳及加工牛乳样品通过各消化阶段后，平均粒径 (图1)、粒径分布(PSD，图2)、微观结构(图3)和表面电势(ζ-电位，图4)的变化分别如图所示。整体上，不同处理牛乳样品从初始到模拟小肠消化结束，其物理化学性质变化趋势相似，消化阶段的影响显著，各处理之间也存在差异，初始阶段、口腔阶段、胃阶段、小肠阶段差异分析以及不同处理MFG对对牛乳脂肪酸释放动力学的影响分析如下：
1.初始阶段
图1 消化阶段和加工处理方式对牛乳样品平均粒径的影响。(a) 表面积平均粒径 (d32)；(b) 消化产物图。
初始阶段，如图1a 所示，生牛乳含有较大的脂肪球颗粒，平均粒径为 3.55 μm，经过均质和均质加热处理的牛乳样品粒径显著减小，平均粒径在0.45 μm 左右，且各加工处理组间没有明显差异。一方面，由于经过均质机的高速剪切、震荡、空穴现象和对流撞击等机械力作用，可以预期MFG 会被显著破碎，从而粒径显著减小(P < 0.05)。另一方面，三种加工乳具有相似的平均粒径，这表明HTST 和UHT 两种热加工方式未能显著改变MFG 的大小(P > 0.05)。该结果可归因于脂肪球间的静电斥力和空间位阻足够抑制它们在热加工过程中发生的絮凝和聚结。
图2 牛乳经过不同加工处理后经各消化阶段后的粒径分布图。(a) 初始；(b) 口腔；(c) 胃；(d) 小肠。
如图2a PSD 所示，所有牛乳样品在初始阶段的PSD 都呈单峰正态分布。其中，生牛乳粒径范围为1 ~ 13 μm，三种加工牛乳粒径范围则为0.10 ~ 3.50 μm。
图3 加工处理对牛乳经过不同消化阶段后微观结构影响。TAG 被尼罗红染为红色，蛋白被FITC染为绿色。标尺 = 20 μm。
如图3 CLSM 微观结构图所示，所有牛乳样品的MFG(红色)在初始阶段都均匀分布于乳浆(绿色)中。已知生乳的MFG 是由天然MFGM 包被，包含有PL、SM、糖酯等极性脂和胆固醇、酶等。CLSM 图表明微观上生乳均匀分散在乳浆中，乳浆中溶解分散有大量蛋白，主要是酪蛋白和乳清蛋白。对于均质乳和均质热加工乳，蛋白质除了分散在乳浆中，在MFG 界面处还可以发现有蛋白吸附。这是由于均质破坏了原来的MFGM包被，同时MFG 粒径大大降低，进而表面积增加，原来的MFGM 不足以包被新形成的脂滴，乳浆中的表面活性物质，即吸附到新形成的界面上。之前有研究发现，主要是乳浆中的酪蛋白吸附到新形成的界面上，还含有少量乳清蛋白。
脂肪球表面带电性和带电量影响到它们的稳定性以及与其他成分的相互作用。我们因此测量了各牛乳样品在模拟消化前后各阶段的ζ-电位。对于初始阶段各牛乳样品的表面电势，如图4 所示，所有样品MFG 表面带负电荷。三种加工后牛乳比生牛乳具有更大的负电性，其ζ-电位值分别为生牛乳-26.43 ｱ 0.97 mV，均质乳-32.85 ｱ 1.16 mV，HTST 均质乳-30.95 ｱ 0.35 mV，UHT 均质乳-31.20 ｱ 0.50 mV。因为天然MFGM 结构被破坏，乳浆中的表面活性蛋白，主要是酪蛋白，吸附到新形成的脂滴表面，所以加工乳和生牛乳间界面组成和结构存在明显差别，进而造成加工乳和生牛乳之间ζ-电位的显著性差异(P < 0.05)。不同加工方式的牛乳间ζ-电位无显著性差异(P > 0.05)，说明加热处理未明显改变脂滴的带电性。尽管如此，牛乳热加工促进了吸附的乳清蛋白变性，并且促进乳清蛋白与酪蛋白或者保留的MFGM之间的相互作用，进而改变界面组成。因此，ζ-电位测定可以反映界面组成的变化，但是只通过电泳法测定的ζ-电位无法地确定界面组成和结构变化的具体分子机制。
2. 口腔阶段
如图1a 所示，当牛乳样品经过模拟口腔消化后，所有样品的平均粒径都显著增大，这表明MFG 间发生了聚集。这些聚集可能是由于模拟口腔液中矿物离子引起的静电屏蔽作用和黏蛋白引起的桥联或损耗絮凝作用。宏观上，从图1b 也可以看到存在较大的凝乳块。如图2(b) PSD 所示，大粒径比例显著增加，这也说明发生了广泛的颗粒聚集。
由于经过模拟口腔阶段消化后，有大量肉眼可见的沉淀存在于试管底部，可推测这些沉淀包含密度大于水的未消化蛋白质、黏蛋白和矿物质。未用CLSM 观察这些大沉淀颗粒，仅观察了上层水相中样品的显微结构，如图3 所示。整体脂滴数量比初始显微镜图片变少，这是由于加入模拟口腔液后样品被稀释，同时有一部分脂滴被包裹在蛋白等絮凝块中而沉淀。CLSM 显微结构图表明经过模拟口腔消化后，加工后牛乳样品发生了明显地聚集，而生乳样品微观结构未见明显变化。相较于生牛乳由天然MFGM 包被，加工乳由剩余的MFGM、酪蛋白和少量乳清蛋白共同包被，更易发生聚集。均质乳脂肪球虽有明显聚集，但仍相对均匀地分散，而两种热加工乳则存在大量的凝乳块。相较于只经过均质处理的牛乳样品，热加工处理由于促进了吸附乳清蛋白的变性，增加了MFG 的表面疏水性和二硫键相互作用，形成更广泛的脂肪球聚集。
图4 消化阶段和加工处理方式对牛乳样品ζ-电位的影响。
如图4 所示，通过模拟口腔消化后，三种加工牛乳的ζ-电位绝对值显著降低 (P <0.05)。相反，生牛乳的ζ-电位基本保持不变。四种牛乳样品的ζ-电位值非常接近，不存在显著性差异。加工牛乳样品MFG 表面电荷的变化可能有以下几种原因：(1)模拟口腔液中的离子引起的静电屏蔽效应；(2) 黏蛋白结合到MFG 表面，加工乳与生牛乳ζ-电位不同的变化可能是由于黏蛋白对它们的MFG 亲和力不同，黏蛋白对加工乳表面蛋白的吸附力强于生乳表面天然MFGM，该推测还需要进一步验证。
3.胃阶段
当牛乳样品经过模拟胃消化后，相较于口腔阶段，样品平均粒径均显著减小(图1a)，这表明经过模拟胃消化后牛乳凝块出现裂解。生牛乳和各加工乳之间平均粒径无显著性差异。宏观上，从图1(b)也可以看到胃消化样品中沉淀明显变少。所有样品的PSD 呈单峰分布，但胃消化后样品粒径仍大于初始阶段 (图2)。经胃消化后，大凝块的破碎存在几个可能原因。首先，胃蛋白酶可以水解牛乳中的蛋白质。其次，从口腔的中性pH 条件到胃的酸性pH 环境，改变了体系的静电相互作用。较后，从口腔到胃，样品被稀释，这也是促进凝块降解的可能原因之一。
从图3 CLSM 微观结构图可以观察到，经过胃消化后牛乳脂肪球结构变化显著。蛋白质凝块的裂解促使之前被包裹的脂肪球释放。对于生牛乳，MFG 仍均匀分散，整体上并无显著絮凝，可见的大粒径MFG 源于部分脂滴的聚结。相反地，三种加工牛乳样品经胃阶段消化可见明显的脂滴絮凝。Gallier 等人也报道生乳MFG 外围的天然膜结构可以保护它们在胃液中不发生絮凝。而经均质和加热处理后，MFG 外围部分被蛋白质包被，已知蛋白质稳定的脂滴在胃中很容易聚集，模拟胃液中的酸性pH、高离子强度和酶活性都是促进脂滴聚集的重要因素。
从图3 可见，经过胃消化后，所有牛乳样品的ζ-电位都由负电性转变为正电性。且ζ-电位绝对值减小至2.52 ~ 3.20 之间，各样品间无显著性差异。模拟胃液具有强酸性(pH 2.5)，该pH 显著低于牛乳蛋白质的等电点pI。因此，理论上蛋白质包被的脂滴应该带有大量正电荷，ζ-电位值高于现有测定结果。现有接近电中性的ζ-电位很大程度上源于模拟口腔液中的黏蛋白。黏蛋白是一种阴离子型生物高分子，当体系pH 从中性降低到2.5 时，其表面所携带的负电荷被中和而减少。胃消化阶段，蛋白质包被的脂滴表面携带正电荷，阴离子型黏蛋白分子可以中和表面正电荷。此外，模拟胃液中的相对高离子强度可引起静电屏蔽和离子吸附作用，这也减小了ζ-电位的绝对值。
4. 小肠阶段
如图1a 所示，经过模拟小肠阶段消化后，所有加工处理过的牛乳样品平均粒径都非常显著地减小(d32 < 0.3 μm)，该结果表明胃消化后形成的大颗粒被分解了。然而，从图2d PSD 可知，这些加工乳的小肠消化产物中仍有一小部分大颗粒。不过，从图1b 可观察到，宏观上经过小肠消化后已经无肉眼可见大颗粒沉淀。相较于胃消化产物，生牛乳经过模拟小肠阶段消化后，平均粒径略有减小(P > 0.05)，且平均粒径(d32 = 7.21 μm)远远高于加工牛乳 (d32 = 0.27 ~ 0.29 μm) (P < 0.05)。PSD 图中生牛乳仍呈单峰型分布，而加工乳呈多峰型分布。
从CLSM 图3 也可观察到，生牛乳经小肠消化后仍具有较大粒径，均质乳和HTST均质乳含有少量脂滴，而UHT 均质乳小肠消化产物中仍分散有相当数量的含脂聚集体，这些未酶解脂滴的存在也表明UHT 均质乳的脂质水解程度低于其他牛乳样品。生牛乳中也可见大的含脂聚集体。值得注意的是，其中一些聚集体似乎是大的MFG 结构被部分消化降解。另外一些含脂聚集体可能来源于胆盐、PL、FFA 和单甘脂等形成的胶束或囊泡结构。如图4 所示，经过小肠消化后，所有牛乳样品具有相对高的负电性表面电势，ζ-电位由胃消化后的弱正电性变为强负电性(从+2.5 mv 到-42.67 ~ -43.77 mV)。该变化是由于小肠消化后的产物是由阴离子型胆盐、PL、FFA 和多肽混合形成的胶体结构，例如胶束、囊泡或者未消化的脂肪球。
5. 不同结构MFG 对牛乳脂肪酸释放动力学的影响
通过pH-stat 法监测MFG 在小肠消化阶段消耗NaOH 的量，来监测牛乳脂肪的消化动力学，如图5 所示，通过消化动力学曲线确定初始水解速率和较终水解程度。
图5 小肠阶段单位体积牛乳释放FFA 动力学曲线
1）较终水解程度
牛乳的较终水解程度由小肠消化2 h 后FFA 释放量来定量，结果较终水解程度取决于加工方式。如图6 所示，均质对于乳脂较终水解程度没有显著影响，但是进一步的热处理使乳脂的较终水解程度降低，且随着加热温度的增加效果愈加明显(生乳 ≈ 均质乳 > HTST 均质乳 > UHT 均质乳)。结果表明即使均质乳脂质的初始水解速率高于生牛乳，小肠阶段2h 消化时间足够消化完全。同时，热加工引起的均质乳MFG 界面成分和结构的变化，在整个小肠消化阶段内抑制了乳脂消化。可以由UHT 乳的小肠消化产物CLSM 图(图3) 中存在未消化完全的乳脂证明。然而，Bourlieu 等人的研究表明热处理实际上增加了脂质的水解程度，但他们只报道了胃阶段消化，小肠上段作为脂质消化主要部位，其消化影响非常重要。
图6 不同加工方式牛乳模拟肠消化阶段较终FFA 释放量
2）初始水解速率
由FFA 释放动力学曲线图5 可以看出，消化初始阶段0 ~ 5 min 内，FFA 释放量相对于消化时间呈线性关系，通过Pearson 相关性分析得出相关性系数R > 0.86，据此计算得到脂肪球初始水解速率，如图7 所示。
图7 不同加工方式牛乳消化FFA 的初始释放速率
四种牛乳样品的初始脂肪消化速率存在显著性差异(P < 0.05)，依此顺序递减：均质乳 > HTST 均质乳 > 生牛乳 > UHT 均质乳。均质处理增加了生牛乳脂质的初始水解速率，因为均质增加了MFG 的表面积，进而增加了与脂肪酶的接触机会。然而，均质乳进一步经热加工处理后，其乳脂初始水解速率降低，且随着加热温度的增加而降低显著，即UHT 均质乳比HTST 均质乳具有更低的初始水解速率。一方面，加热处理导致蛋白质变性和分子间交联，改变了脂肪球界面结构，抑制胆盐和脂肪酶吸附。而另一方面，热处理促使脂肪球的更多絮凝，这也对脂肪酶在脂肪球表面的吸附造成阻碍。均质和热处理带来的界面面积和组成的变化，对乳脂初始水解速率起到相反作用。虽然HTST 均质乳和UHT 均质乳相较于生乳表面积增加，但是热处理降低了脂肪酶作用位点，这也解释了为什么检测到生牛乳初始水解速率介于HTST 均质乳和UHT 均质乳之间。
Bourlieu 等人研究了三种界面结构和组成的模式配方乳的体外模拟婴儿胃消化特性，包括生牛乳、均质乳和HTST 牛乳。蛋白消化结果显示酪蛋白被胃蛋白酶水解速率为生牛乳 < HTST 乳 < 均质乳，β-乳球蛋白不被酶解，α-乳白蛋白酶解速率三种乳差别不显著。其结果说明在进入小肠消化之前，胃蛋白酶作用对于不同加工处理程度乳脂肪球蛋白消化的影响不同。这将直接影响MFG 在进入小肠阶段的初始水解速率，本文小肠阶段初始水解速率结果与其报道的蛋白酶解情况一致。
总结：
本实验通过乳制品生产过程中常用的微射流高压均质和杀菌处理得到不同结构的MFG，利用三阶段体外模拟消化模型，研究了不同结构MFG 的胃肠道消化特性，得到以下主要结论：
(1) 不同牛乳样品在不同消化阶段间，物理化学性质整体变化趋势相似，都受到消化阶段显著影响。但相同消化阶段内，各样品存在差异。
(2) MFG 的粒径大小和表面性质被加工处理改变，显著影响MFG 在胃肠道消化过程中的物理稳定性。经模拟口腔和胃消化后，MFG 粒径都有所增加，尤其是口腔阶段，胃肠阶段相对前一阶段有所下降。生牛乳经模拟口腔和胃消化后，仍保持相对稳定均匀分散，而加工乳聚集絮凝明显，而且在口腔阶段形成肉眼可见凝块沉淀。
(3) 不同结构MFG 的ζ-电位变化结果为，除在初始阶段差异显著，加工乳比生乳ζ-电位绝对值有所增加，其他消化阶段差异均不显著，ζ-电位受消化环境影响显著。
(4) FFA 释放动力学显示，初始水解速率大小为均质乳 > HTST 均质乳 > 生牛乳 >UHT 均质乳，较终水解程度大小为生乳 ≈ 均质乳 > HTST 均质乳 > UHT 均质乳。对乳脂初始水解速率和较终水解程度而言，微射流高压均质和加热两种加工方式作用相反。均质增加了表面积，促进初始水解速率。而随着加热强度增加，乳脂较终水解程度下降明显，虽然UHT 乳的粒径较小，但因加热处理，其初始水解速率小于生牛乳。综上，微射流高压均质和热处理引起MFG 粒径大小和界面成分变化，影响胃肠消化各阶段MFG 的物理化学稳定性，进而对脂解初始速率和较终程度造成影响。结果说明，MFGM是乳脂消化特性的基础。
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